طرق توسيم المجسات (labeling of probes) للكشف عن الجين الهدف
المؤلف:
د. محمد باقر صاحب الشهيب , أ.د. علي حمود السعدي , أ.د. حيدر كامل زيدان
المصدر:
مبادئ الوراثة الجزيئية
الجزء والصفحة:
ص370-372
2025-05-14
456
قبل التطرق الى الكشف عن الجين لابد للقارئ من معرفة كيفية توسيم المجسات المخصصة للكشف عن تسلسل الجين الهدف. هنالك عدة طرق لوسم المجسات كما في طريقة التوسيم الطرفي (end labeling) ، والتي يستخدم فيها انزيم polynucleotide kinase لنقل مجموعة الفوسفات الطرفية في جزيئة الـ ATP الى المجموعة الهيدروكسيلية الطرفية من نوع 5' في جزيئات الأحماض النووية. واذا كان الـ ATP الواهب موسوم اشعاعياً ينتج هذا في حمض نووي معلم اشعاعياً من النهاية '5 (شكل 1).
الشكل (1) التوسيم الطرفي للـ DNA باستخدام انزيم polynucleotide kinase والذي يختصر بـ PNK . في الخطوة الأولى تزال مجموعة الفوسفات بواسطة انزيم الـ Phosphatase لتوليد مجاميع هيدروكسيل من نوع 5' . وفي الخطوة الثانية تنقل الفوسفات الطرفية [γ- 32P] ATP ( الدائرة الصلدة ) بعد ذلك الى النهاية 5' بواسطة انزيم PNK ( تصميم المؤلف).
ويمكن توليد حمض نووي موسوم من نهايته الهيدروكسيلية من نوع '3 وذلك عن طریق انزيم terminal transferase وهو نفس الانزيم المستخدم في التذييل المتجانس (homopolymer tailing). ويعتبر التوسيم من النهاية 5' أو 3' هما الطريقتان الشائعتان لتوسيم البوادئ أو متعددات النيوكليوتيدات القليلة (oligonucleotides) لأن تلك الطريقتان يمكن استخدامهما بالاشرطة المفردة اضافة الى الاشرطة المزدوجة، أما اذا كانت جزيئات الحمض النووي ذات شريط مزدوج، فتوجد طرق أخرى لتوسيمها بالاضافة الى الطريقتين السابقتين. كما في انتقال الثلمة ( nick translation)، والتي وتعول على قابلية انزيم DNA polymerase I على نقل الثلمة المخلقة في آصرة الفوسفات ثنائية الأستر على طول الـ (DNA) في العمود الفقري لحلزون الـ DNA المزدوج . ربما تحدث الثلمات بشكل طبيعي أو ربما تتسبب عن طريق وجود حتى ولو تركيز واطئ من الانزيم الهاضم DNase في خليط التفاعل. يحفز انزيم DNA polymerase I تفاعل ازالة الشريط ( strand displacement reaction) والذي يدمج نيوكليوسيدات ثلاثية الفوسفات (dNTPS) جديدة في سلسلة الـ DNA، وهنا اذا تم تجهيز خليط التفاعل بأحد أنواع الـ dNTPS الأربعة بشكل موسوم اشعاعياً، فالنتيجة تكون DNA موسوم اشعاعياً بشكل كبير (شكل 2).
الشكل (2) وسم الـ DNA بواسطة انتقال الثلمة. في البداية يتكون الشق أحادي الشريط في آصرة الفوسفات ثنائية الأستر في العمود الفقري في قطعة الـ DNA باستخدام انزيم. DNase I ثم يقوم DNA polymerase I بتخليق نسخة من الشريط القالب، محطماً الشريط غير القالب بفعاليته المحطمة. 5'-3' exonuclease activity واذا تم تجهيز أحد النيوكليوسيدات ثلاثية الفوسفات [α-32P]dNTP الموسومة اشعاعياً يؤدي هذا الى اندماج الاشعاع الى الشريط الجديد المخلق حديثاً (تصميم المؤلف( .
هنالك طريقة أخرى للتوسيم تتم بواسطة امتداد البادئ ( labeling by primer extension) وتسمى أيضاً بالتوسيم ذو النيوكليوتيدات المتعددة الصغيرة (oligolabelling)، والتي تستخدم نيوكليوتيدات متعددة عشوائية (نيوكليوتيدات سداسية عادة) لبدء تخليق شريط الـ DNA بواسطة انزیم DNA polymerase .يتم مسخ الـ DNA المراد توسيمه بالحرارة، ومن ثم ترتبط البوادئ بالـ DNA المفرد الشريط.
ويمكن لقطعة كلينو ( Klenow fragment) لانزيم الـ DNA polymerase من أن تخلق نسخة من الشريط القالب، والذي يبتدئ من النهاية الهيدروكسيلية 3' للنيوكليوتيدات المتعددة. واذا اندمجت أحد أنواع الـ dNTP الموسومة، يتم عندها انتاج DNA موسوم (شكل 3). ويتم تنفيذ هذه الطريقة بواسطة تقنية الـ PCR .
الشكل (3) توسيم الـ DNA بواسطة امتداد البادئ. أولاً يمسخ الـ DNA لاعطاء نيوكليوتيدات مفردة الشريط. ثم يضاف البادئ ليعطى منطقة صغيرة مزدوجة الشريط ذات نهاية هيدروكسيلية حرة من نوع 3'. ثم تقوم قطعة كلينو التابعة لانزيم DNA polymerase I بتخليق نسخة من الشريط القالب امتداداً من البادئ، وذلك بدمجها أحد أنواع النيوكليوسيدات الموسومة اشعاعياً [α-32P]dNTP مثلاً لانتاج جزيئة موسومة (تصميم المؤلف).
مهما اختلفت طريقة التوسيم، لابد من فصل الـ DNA الموسوم عن الـ DNA الغير موسوم الموجود في مزيج التفاعل. لابد من ملاحظة ان في معظم تفاعلات التوسيم لاتنحشر كل الـ dNTPs الموسومة اشعاعياً في التسلسل الهدف، لذا لابد من ايجاد طريقة ما لفصل النواتج الموسومة عن نظيراتها الغير موسومة. وهنالك طريقة بسيطة لانجاز ذلك تتلخص باستخدام الترشيح بالهلام ((gel filtration باستخدام وسط ملائم. ويمكن اتمام كل هذه العملية بماصة باستور، حيث يصل الـ DNA الموسوم الى العمود أولاً، ويتبع بعد ذلك بالنيوكليوتيدات الحرة. يتم جمع الاجزاء (fractions) ومراقبة قوة الاشعاع فيها.
الاكثر قراءة في مواضيع عامة في الاحياء الجزيئي
اخر الاخبار
اخبار العتبة العباسية المقدسة
